引入磁荧光波动显微光谱技术，以研究生物学中的量子效应

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对于生物体系中自由基对及其量子特性的理解仍处于起步阶段，这主要受限于高灵敏度仪器的缺乏，以及生化反应的复杂性和磁场诱导自由基对反应的微弱变化（低至或低于百分之一）。该研究团队设计的新型光学系统能以高信噪比捕捉生物体系的量子力学特性。开发的磁荧光波动显微光谱技术可检测低至0.2%的荧光信号磁场效应（接近单光子水平，采用单光子雪崩二极管），并在23种分子上验证了该技术的有效性。该系统还配备了电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机作为辅助检测模块，通过新型数字锁相放大技术实现相位敏感的磁场空间分布成像。上述功能在模型生物体系的自由基对光化学反应中得到验证。该仪器通过磁场效应揭示了蛋白质-黄素相互作用中光降解现象的重要性，这一发现将为探索生物环境中的类似量子效应提供关键研究工具。

Luke P. Lee认为[1]：“Lewis Antill 和同事在 Nature Photonics 上撰文，开发了一种磁荧光波动显微光谱（MFFMS）技术，该技术允许在接近单分子水平上监测蛋白质-配体复合物中的量子相干效应，有望在生物系统中应用。”

图1 MFFMS实验原理图

研究生物体系中的自由基对需要多种技术手段来揭示其复杂机制。该研究将荧光波动光谱(FFS)与磁场效应(MFE)方法相结合，通过监测黄素荧光的变化，MFFMS技术可提供多种定量信息，包括距离测量、结合状态、扩散系数、分子数量、自由基对动力学以及蛋白质-配体和蛋白质-蛋白质相互作用等。

对比传统技术局限，本研究的解决方法：

图2 基于SPAD检测的模型体系MFE研究

SPAD技术实现了模型体系中黄素蛋白复合物的超高灵敏度MFE检测，首次在约7光子水平解析了自由基对的量子动力学行为。研究发现，黄素光降解产物（如缺失磷酸基的光黄素）会显著影响蛋白-配体相互作用，其中溶菌酶（HEWL）与黄素单核苷酸（FMN）通过表面静电作用形成非特异性结合，而牛血清白蛋白（BSA）与FMN则呈现特异性口袋结合，二者表现出截然不同的MFE响应模式：HEWL-FMN体系随流速变化显示三重态自由基对主导的MFE变化，而BSA-FMN在高流速时出现单重态自由基对特征。这些发现不仅揭示了蛋白结合特性与自由基对自旋态的构效关系，更为在活细胞环境中研究生物量子效应建立了高灵敏度的检测新范式。

创新点图示：

图3 EMCCD检测的MFE与数字锁相（DLIA）分析

此外，创新性地开发了基于EMCCD- DLIA联用的空间分辨磁场效应检测技术，通过0.25 Hz磁场调制和数字锁相放大方法，成功实现了对HEWL-FMN自由基对200 ms响应时间的精确测量（上升/衰减速率分别为4.76±0.98 s⁻¹和5.08±0.95 s⁻¹）。该技术将MFE检测灵敏度提升至-1.37%（较原始数据提高2.3倍），并具备单次实验处理16800帧图像的高通量分析能力，有效克服了活细胞环境中的光漂白干扰。通过13阶谐波重构的FFT/IFFT（快速傅里叶变换/逆快速傅里叶变换）算法，首次实现了0.1%级弱信号的精准提取，为亚细胞尺度量子生物学研究提供了兼具空间分辨率和时间精度的创新工具。

创新点图示：

图4 BSA-FMN复合物的竞争性结合实验与模拟分析

通过分子对接、竞争性结合实验和分子动力学模拟，系统揭示了BSA蛋白中FMN通过特异性结合口袋2（与W211残基形成≤4Å关键间距）产生单重态自由基对的分子机制。实验证实该结合可被萘普生（Kd=5.8×10-7 M）竞争性抑制，而MD模拟显示FMN在口袋内的动态扩散（3.5-6.5 Å）维持了自旋相干所需的电子间距，这为理解流速依赖性MFE变化提供了结构基础，首次建立了蛋白质结合微环境与自由基对量子行为的定量构效关系。

创新点图示：

本研究首次实现SPAD的MFE检测，为单分子水平研究蛋白质-配体的磁敏感光化学开辟了新途径。DLIA分析进一步实现了荧光图像中的MFE提取，通过剔除杂散信号，为定位细胞内的磁敏感位点提供了有力工具。结合荧光强度、各向异性和MFE的多参数测量，可更全面揭示蛋白质-配体动力学本质。未来将通过安装时间相关器，实现SC-AOTF（超连续光源-声光可调滤光片组合）与SPAD联用的皮秒时间分辨测量（如荧光寿命成像、时间分辨FRET（荧光共振能量转移）及MFE）。增设第二个SPAD将支持荧光互相关光谱和FRET测量，结合现有技术，目前已在黄素和黄素蛋白的体外/体内环境中展开应用。